發(fā)布時間：2021-12-30 15:06:21
Ames鼠傷寒沙門氏桿菌回復突變試驗-ISO 10993-3, GB/T 16886.3, YY/T 0127.10
Ames試驗全稱鼠傷寒沙門氏桿菌回復突變試驗。
實驗目的和原料：
鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella
typhimurium）的組氨酸營養(yǎng)缺陷型（his－）菌株，在含微量組氨酸的培養(yǎng)基中，除極少數(shù)自發(fā)回復突變的細胞外，一般只能分裂幾次，形成在顯微鏡下才能見到的微菌落。受誘變劑作用后，大量細胞發(fā)生回復突變，自行合成組氨酸，發(fā)育成肉眼可見的菌落。某些化學物質需經(jīng)代謝活化才有致變作用，在測試系統(tǒng)中加入哺乳動物微粒體酶，可彌補體外試驗缺乏代謝活化系統(tǒng)之不足。
應用標準
GB/T 16886.3 , ISO 10993-3 , ISO/TR 10993-33 , ISO 7405 , YY/T 0870.1 , YY/T 0127.10
Ames試驗的常規(guī)方法有斑點試驗和平板摻入試驗。
1．菌株鑒定
用于測試的菌株，需經(jīng)基因型和生物學性狀鑒定，符合要求才能投入使用。
目前推薦使用的一套菌株是TA97、TA98、TA100和TA102。鑒定前先進行增菌培養(yǎng)。為鑒定結果可靠，需同時培養(yǎng)野生型TV菌株，作為測試菌基因型之對照。增菌培養(yǎng)用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，接種后于37℃，100r/min振蕩培養(yǎng)12h左右，細菌生長相為對數(shù)期末，含菌數(shù)應為1×109個/ml～2×109個/ml。
鑒定項目：
（1）脂多糖屏障丟失（rfa）用接種環(huán)或一端撓起的接種針以無菌操作術取各菌株的增菌培養(yǎng)液，在營養(yǎng)瓊脂平板上分別劃平行線，然后用滅菌尖頭鑷夾取滅菌濾紙條，浸濕結晶紫溶液，貼放在平板上與各接種平行線垂直相交。蓋好皿蓋后倒置于37t溫箱，培養(yǎng)24h后觀察結果。
（2）R因子 劃線接種，貼放濾紙條及培養(yǎng)等均同上，唯濾紙條浸濕的藥液不同，為氨芐青霉素鈉溶液。TA102除pKM101外，還有pAQ1，載有抗四環(huán)素的基因，故另用濾紙條浸濕四環(huán)素溶液后貼放于劃線接種的平板上。
（3）紫外線損傷修復缺陷（△uvrB）在營養(yǎng)瓊脂平板上按上述方法劃線接種后，一半接種線用黑玻璃遮蓋，另一半暴露于紫外光下8sec，然后蓋好皿蓋并用黑紙包裹平皿，防止可見光修復作用。培養(yǎng)同上。
（4）自發(fā)回變 預先制備底平板；向滅菌并在水浴內保溫45℃的上層軟瓊脂中注入0.1ml菌液；混勻后傾于底平板上并鋪平。平皿倒置于37℃溫箱培養(yǎng)48h。
（5）回變特性——診斷性試驗 上層軟瓊脂中除菌液外，還注入已知陽性物之溶液，需活化系統(tǒng)者并加入S9mix，余同上。
組氨酸營養(yǎng)缺陷型由自發(fā)回變即可知。
2．斑點試驗
吸取測試菌增菌培養(yǎng)后的菌液0.1ml，注入融化并保溫45℃左右的上層軟瓊脂中，需S9活化的再加0.3ml－0.4mlS9mix，立即混勻，傾于底平板上，鋪平冷凝。用滅菌尖頭鑷夾滅菌圓濾紙片邊緣，紙片浸濕受試物溶液，或直接取固態(tài)受試物，貼放于上層培養(yǎng)基的表面。同時做溶劑對照和陽性對照，分別貼放于平板上相應位置。平皿倒置于37℃溫箱培養(yǎng)48h。在紙片外圍長出密集菌落圈，為陽性；菌落散布，密度與自發(fā)回變相似，為陰性。
3．平板摻入試驗
將一定量樣液和0.1ml測試菌液均加入上層軟瓊脂中，需代謝活化的再加0.3ml－0.4ml
S9mix，混勻后迅速傾于底平板上鋪平冷凝。同時做陰性和陽性對照，每種處理做3個平行。試樣通常設4個～5個劑量。選擇劑量范圍開始應大些，有陽性或可疑陽性結果時，再在較窄的劑量范圍內確定劑量反應關系。培養(yǎng)同上。同一劑量各皿回變菌落均數(shù)與各陰性對照皿自發(fā)回變菌落均數(shù)之比，為致變比（MR）。MR值≥2，且有劑量-反應關系，背景正常，則判為致突變陽性。
送樣要求
ISO 10993-3標準：固體或粉末狀： 3個完整樣品，每個樣品需60 cm2 或 4 g及以上； 液體或化學品：15ml及以上
GB/T 16886.3標準：固體或粉末狀： 3個完整樣品，每個樣品需60 cm2 或 4 g及以上； 液體或化學品：15ml及以上
YY/T 0127.10標準： 固體或粉末狀： 3個完整樣品，每個樣品需60 cm2 或 4 g及以上； 液體或化學品：15ml及以上
